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本产品是一种基于化学而非去污剂方法的高产膜蛋白提取试剂盒，适用于从昆虫组织或培养细胞中温和、高效地抽提质膜蛋白。用本试剂盒抽提和富集到的蛋白包括从分子量很小到很大的蛋白，单次跨膜至7次以上的蛋白，甚至一些大的蛋白复合物。提取过程简单方便，可在1小时内完成。提取的膜蛋白不仅纯度高，保持天然活性，而且绝少交叉污染。

本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

本试剂盒提取的蛋白含高浓度盐，不可直接用于2D电泳，如下游实验需直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用其他货号试剂盒（HR0165）。也可将最后样品除盐后再用于2D电泳，用脱盐柱脱盐处理（HR0389）。

• 使用方便，从昆虫细胞，组织中提取蛋白不需经过反复冻融、超声破碎等前处理。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。

• 提取液准备：
  每500μL冷的蛋白提取液A中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置冰上备用。
  注：
  ● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
  
• 取适量昆虫组织样本用剪刀尽可能剪碎，置于研钵中用液氮研磨。
  注：没有液氮也可直接加入试剂A置冰上研磨即可。
  
• 研磨后加入500μL冷的提取液A，混匀后移入一个预冷的干净离心管中，在2～8℃振荡1小时。
  注：
  ● 此步骤必须在2～8℃条件振荡。
  ● 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
  ● 如果无2～8℃振荡条件，也可2～8℃冰箱静置，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔10分钟涡旋混匀。
  
• 将提取液在2～8℃低温下10000×g离心5分钟，取上清。
  
• 在上清中加入10μL抽提液B，充分混匀。
  
• 在37℃水浴10分钟。
  
• 在37℃，1000×g离心3分钟。
  注：
  ● 此步骤必须在37℃条件下离心。
  ● 没有37℃离心条件也可以不离心，稍微延长37℃水浴时间，至液体澄清，分层清晰。
  
• 此时溶液会分为2层，小心移除上层，吸取下层管底部膜蛋白部分大约30～50μL液体。
  注：膜蛋白部分为粘稠状液体。
  
• 用50～150μL试剂C溶解该下层溶液，即得质膜蛋白样品。
  
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
  注：
  ● 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：HR0329。
  ● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 蛋白浓度低？
  膜蛋白丰度比较低，在条件允许的情况下，需要尽可能加大昆虫样品的上样量以提高膜蛋白浓度。
  处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。